отношении исчезающих видов животных следует иметь в виду еще один путь сохранения мужских половых клеток - замораживание Семенников погибших в зоопарках или питомниках животных с последующей имплантацией их кастрированным самцам. Такие опыты были проведены на птицах советскими исследователями Б.Г.Новиковым и Л.И.Любарской, которые показали, что спустя несколько недель в пересаженных после оттаивания семенниках происходило образование зрелых сперматозоидов. Конечно, для целей сохранения исчезающих видов имеет смысл производить пересадки семенников исчезающего вида самцам обычных видов, то есть межвидовые пересадки (Вуд и др., 1990).

1.4.4. Замораживание яйцеклеток

Этот метод значительно более труден и поэтому менее разработан, чем метод замораживания сперматозоидов. Яйцеклетки легко повреждаются при замораживании, в первую очередь, по-видимому, из-за их значительно больших размеров по сравнению со спермиями, рыхлой структурой ядерного аппарата и значительно большим содержанием воды. Пока удалось осуществить оплодотворение замороженных и оттаянных яйцеклеток у мышей, крыс и хомяков, а развитие до рождения оплодотворенной после оттаивания яйцеклетки наблюдали только у мышей. Более перспективным может оказаться замораживание яичников, в которых имеются» наряду с крупными, также и мелкие половые клетки, более успешно выдерживающие замораживание. После оттаивания такие яичники имплантируют кастрированной самке, и половые клетки завершают свое развитие, Такие опыты были успешно проведены на мышах и крысах. Однако в этих случаях замороженные и оттаянные яичники имплантировали самке того же вида. Между тем возможна такая ситуация, при которой последняя самка исчезающего вида погибнет, и от нее сохранятся только замороженные яичники, В этой связи большой интерес представляют опыты по межвидовой пересадке яичников проведенные на дрозофиле, хвостатых амфибиях и птицах. Во всех случаях яичники, пересаженные от одного вида животного к другому, были способны образовать яйца, из которых развивались зародыши того вида, от которого был взят яичник (Вепринцев, Ротт, 1984).

1.4.5. Замораживание зародышей

Замораживание зародышей было впервые проведено в 1971 г. на мышах. После оттаивания зародышей имплантировали в матку «приемной матери», где они продолжали свое развитие. К настоящему времени удалось разработать методику замораживания зародышей крупного рогатого скота, овец, коз, кроликов, крыс. У всех этих видов замороженные зародыши после оттаивания и трансплантации приемной матери продолжают успешно развиваться до рождения. Замораживание производится в присутствии криопротекторов - глицерина полиэтиленгликоля или диметилсульфоксида. У хомяков и свиней зародыши после замораживания и оттаивания зародыши остались живыми но до рождения их развитие не доходило. Удалось кратковременно сохранять замороженных зародышей трески, лососевых рыб морских ежей и кальмаров (Grunina, Neifakh, 1997).

В нашей стране освоена методика замораживания зародышей лабораторных мышей, овец, кроликов и крупного рогатого скота. Метод замораживания зародышей имеет большое значение в практике сельского хозяйства, медицины и экспериментальных исследований. Во-первых, он позволяет сохранить генотип не только самцов, но и самок, выдающихся по своим хозяйственно-ценным признакам, и размножить их путем трансплантации зародышей приемным матерям. Во-вторых, он позволяет накопить большое количество однородного по возрасту и происхождению эмбриологического материала, что особенно важно при проведении биохимических исследований. В-третьих, он позволяет значительно упростить транспортировку сельскохозяйственных животных ценных пород и лабораторных животных. Ввоз замороженных зародышей - единственный способ импорта ценных пород и линий для тех стран, куда ввоз животных запрещен таможенными правилами, например в Австралию. Наконец, хранение замороженных зародышей позволяет получать детенышей в наиболее удобное время года (например, потомство от сельскохозяйственных животных - весной) (Межевикина, Каранова, 1995).

1.4.6. Замораживание соматических клеток

Длительное сохранение клеток в глубокозамороженном состоянии стало обычным методом для лабораторий, работающих с клеточными культурами. Обычно используют медленное замораживание со скоростью около 1°С в минуту и размораживание со скоростью 5-10°С в минуту, помещая ампулы с культурой в водяную баню при +37°С.В качестве криопротекторов используют глицерин. Практически удается заморозить клетки самых различных тканей (Ананьев, 1997).

Клеточные культуры - необходимый инструмент исследований, проводимых в биологии и медицине, а также биотехнологии. Они необходимы для получения вакцин и сывороток, поиска и проверки новых лекарственных препаратов, диагностики заболеваний производства физиологически активных соединений, в том числе интерферона - крайне активного антивирусного препарата (Fahy, 1986).

Использование гибридных клеток дало возможность получать моноклинальные антитела, специфичные по отношению к определенному антигену. Это позволяет создавать иммунные антитела (сыворотки), не обладающие побочным действием (там же).

Всеми этими достижениями фундаментальная наука и биотехнология обязаны в значительной степени сохранению различных клеточных линий. Первая коллекция клеточных культур для нужд медицины и биологии была основана в США в 1925 г. В России научно-исследовательские институты различных ведомств имеют свои коллекции клеточных культур, в том числе сохраняемые в замороженном виде. В настоящее время в системе РАН создается Всесоюзная коллекция клеточных культур (Шпаро, 1983).

Сохранение в коллекциях глубокозамороженных соматических клеток различных животных может оказаться полезным не только для генной инженерии, но и для сохранения генетической информации об исчезающих видах животных, изучения их генетики (Карнаухов, 1994).

1.4.7. Длительность хранения замороженных клеток

По прогнозам ученых, человечество достигнет «экологического равновесия» к началу XХII в. Предполагается, что приблизительно через 120 лет можно будет выпустить в природу животных, как сохраненных в зоопарках, питомниках и фермах, так и восстановленных из замороженных клеток. Поэтому при использовании метода глубокого замораживания клеток, как способа сохранения генетической информации большое значение имеет вопрос о длительности сохранения замороженными клетками жизнеспособности и генетической неизменности (Вепринцев, Ротт, 1985).

Криоконсервация как метод сохранения половых клеток сельскохозяйственных животных для искусственного осеменения возникла в конце 40-х годов нашего столетия. Первоначально клетки пытались сохранять при температуре сухого льда, то есть -78°С, однако очень скоро выяснилось, что при этой температуре качество семени быстро ухудшается. При температурах ниже -130°С, то есть температуре, при которой уже не идет перекристаллизация льда, заметного ухудшения не возникает (Вепринцев, Ротт, 1985).

Поскольку сам метод глубокого замораживания существует сравнительно недавно, всего несколько десятков лет, нет достаточных экспериментальных данных для ответа на вопрос, как долго замороженные клетки сохраняют жизнеспособность и генетическую неизменность. Однако есть все основания надеяться, что значительная часть клеток при -196°С сохранит жизнеспособность в течение десятков и даже сотен лет. Существующая практика животноводства показывает, что потомство быков, семя которых хранилось в течение 25 лет в замороженном состоянии оказалось совершенно нормальным (там же).

При температуре -196°С практически не идут биохимические реакции. Однако клетки, в частности их геном, могут повреждаться за счет радиоактивного фона Земли и космического излучения. Радиоактивный фон Земли создается излучением радиоактивных веществ, существующих в природе и образующихся в результате атомных испытаний, атомной энергетики, излучения рентгеновской и изотопной аппаратуры, применяемой в медицине и промышленности. Суммарная мощность космического излучения и радиоактивного фона Земли мала: она не превышает 0,2 рад/г. Доза, при которой погибает 63% животных, составляет от 6ОО рад до нескольких тысяч, в зависимости от вида животного (Наук и др., 1991).

Расчеты времени, в течение которого можно быть уверенным в получении полноценного потомства из замороженных клеток, были проведены тремя независимыми способами:

1) анализ экспериментальных кривых летального действия ионизирующих излучений на клетки млекопитающих показал, что доза излучения, при которой выживает 37% половых клеток, при существующем уровне радиации при температуре -196°С может быть только за 200 лет. Эта оценка была сделана американским криобиологом Мазуром;

2) расчет числа повреждений, возникающих при хранении на фоне существующей радиоактивности, при ~196°С показал, что число невосстанавливаемых повреждений ДНК не превышает 10 при изменении в течение 300 лет на один геном половой клетки млекопитающих. Это существенно меньше числа повреждений, при которых гибнет 63% половых клеток;

3) мышиных зародышей, хранившихся в жидком азоте, в течение 13 лет облучали при мощности дозы, в 100 раз превышающее уровень фона. После этого зародыши были разморожены и пересажены в матки самок - «приемных матерей». Родившиеся мышата были нормальными по жизнеспособности и плодовитости и число мутаций, проявившихся у их потомков, не отличались от контроля. Таким образом, существующие на сегодня данные, как экспериментальные, так и полученные путем теоретических расчетов, показывают, что допустимое время хранения половых клеток в глубокозамороженном состоянии без существенного повреждения их организма при существующем на сегодня на Земле радиоактивном фоне составляет не менее 20О лет. Возможно, что в действительности оно много больше (Somme, 1982).

Тепловые мутации, то есть мутации, при температуре жидкого азота практически не возникают. Иначе бы не было радиоактивного фона, то клетки в азоте можно было бы хранить практически вечно (O Neil, Mac Neill, 1993).

До сих пор экспериментально не выяснена в достаточной степени возможность возникновения мутаций в ходе самого процесса замораживания и оттаивания клеток. Нет также данных о преимущественном отборе каких-либо генотипов при замораживании популяции однотипных клеток (Бергман, Найденко, 1992).

Возможно, перспективным окажется при длительных сроках хранения генов использование специальных веществ, замедляющих в случае невозможности глубокого замораживания такие образцы могут быть фиксированы спиртом или феноксиэтанолом, не разрушает химическую структуру ДНК (Вепринцев, Ротт, 1984)

1.4.8. Способы получения живых животных из замороженных спермиев

Как известно, развитие всех живых организмов, размножающихся половым путем, начинается слиянием мужской и женской половых клеток. Однако существуют, по крайней мере, два пути воссоздания вида, от которого сохранились только замороженные спермин.

Первый путь - оплодотворение такими спермиями яйцеклетки самки другого вида, то есть межвидовая гибридизация (Алтухов, 1989).

Очевидно, что невозможность скрещивания с другими видами - необходимое условие существования вида как такового. Однако эта невозможность может обеспечиваться различными путями. Во-первых, виды могут не скрещиваться просто в силу их пространственной изоляции. В таком случае, оказавшись в одном месте, виды могут образовать гибриды. Скрещиванием белуги со стерлядью была получена новая форма - бестер, имеющая значение при товарном выращивании (Алтухов, 1989).

Большую сложность представляют случаи, когда наблюдается так называемая физиологическая изоляция вида, то есть неспособность его к скрещиванию с другими видами. Такая изоляция может быть вызвана раз-личными причинами. Одна из наиболее преодолимых - это различия в поведенческих реакциях. В таком случае достаточно применить искусственное осеменение самок. Сложнее случай, когда спермин оказываются нежизнеспособными в половых путях самки другого вида. Способ преодоления этого препятствия - разработка методов оплодотворения яйцеклетки в пробирке. Этот этап представляет значительные трудности, так как перед проникновением в цитоплазму яйца спермий претерпевает ряд физиологических и морфологических изменений, связанных с взаимодействием спермия с наружными оболочками яйцеклетки, или со средой половых путей самки. Для имитации этих взаимодействий оплодотворение приходится производить в специально подобранных средах. Для 14 видов млекопитающих удалось подобрать такие среды, в которых осуществляется проникновение спермия в цитоплазму яйцеклетки. У 4 видов после введения таких оплодотворенных яйцеклеток в матку самки они развивались до рождения детенышей. Большое внимание привлекли работы с оплодотворением в пробирке яйцеклеток человека (Вепринцев, Ротт, 1984).

Таким образом, анализ литературы по криоконсервации показывает, что в данном направлении достигнуты довольно значительные результаты, однако ряд вопросов, связанных с замораживанием и оттаиванием спермиев рыб и других животных остается не выясненным. Так актуальным остается вопрос об видоспецифичности криопротекторов для разных видов осетровых. В месте с тем, до конца не установлено качество спермы, пригодной для криоконсервации.

Исходя из выше сказанного и анализа литературных источников целью данной работы явилось разрешение следующих задач:

1. Оценить качество спермы от разных самцов русского осетра и севрюги. Для замораживания отобрать сперму только высокого качества, отвечающую рыбоводным показателям.

2. Установить адекватность принятых оценок - время жизни и процент подвижных спермиев в биологической пробе на разных этапах замораживания-оттаивания (нативная сперма, сперма после дефростации, сперма после оттаивания).

3. Оценить роль каждого вещества в составе многокомпонентного криопротектора.

4. Выявить оптимальные составы криопротекторов для спермы русского осетра и севрюги.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Работа проведена в период май-июль месяцы 2006 года на Александровской осетровом рыбоводном заводе Севкаспрыбвода.

Количество проведенных опытов по подготовке и реализации исследо-ваний представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Объем экспериментального материала.


№ п/п	Наименование работ	Всего Опытов
1.	Оценка качества нативной спермы русского осетра	35
2.	Оценка качества нативной спермы севрюги	35
3.	Подбор концентраций компонентов криопротектора	20
4.	Сравнение протекторов на сперме русского осетра (время жизни)	120
5.	Сравнение протекторов на сперме русского осетра (% подвижных спермиев)	120
6.	Сравнение протекторов на сперме севрюги (время жизни)	120
7.	Сравнение протекторов на сперме севрюги (% подвижных спермиев)	120
Всего опытов	570

Сперму от самцов русского осетра и севрюги отбирали методом сцеживания. Ее до замораживания хранили в холодильнике при t = +4°С. Время хранения от 1.5 часов до 2 суток.

Перед замораживанием сперму первоначально смешивали с одним из образцов криопротектора, затем смесь оставляли на эквилибрацию (до 40 минут) при комнатной температуре. После этого образцы раскапывали в пробирки Эпендорфа и начинали замораживание в парах жидкого азота. Для этого замаркированные пробирки помещали на площадку, которая находилась в емкости с жидким азотом и «плавала» на его поверхности (рис. 1). Температура на поверхности пластины - -70 - -100°С. Время выдерживания образца в парах жидкого азота устанавливали экспериментально, после чего последний погружали в жидкий азот (t = -196°С). Вместе с тем апробировали способ сверхбыстрой заморозки спермы на тефлоновом планшете (рис. 3), которую помещали на поверхность жидкого азота в кювету. Сперму автоматическими пипетками раскапывали по гнездам пластины. Замороженные шарики ссыпали в емкость, объемом до 20 мл., которую помещали в жидкий азот.

Для проведения исследований влияния скоростей замораживания на качество и жизнестойкость образцов было необходимо осуществить калибровку температур в опытной камере. Рофиль распределения температур в зависимости от расстояния до поверхности жидкого азота приведен на рис. 2.

Рис. 1 Установка для замораживания образцов.

1 - емкость. 2 - жидкий азот. 3 - пенопластовая пластина на поверхности жидкого азота. 4 - замораживаемый образец.

Рис. 2. Профиль температуры в экспериментальной установке.

Размораживание образца осуществляли следующим образом. Быстрый вариант. Образец помещали под водяную баню, где температуру среды поддерживали 36-38°С. После оттаивания (время от 2 до 4 минут) замороженный образец помещали в базовый раствор для отмывки от криопротектора. Время отмывки для каждого вида осетровых рыб устанавливали отдельно.

Рис. 3. Планшет для быстрой заморозки образцов.

Рис. 4. Установка для замораживания спермы осетровых рыб.

За выходные показатели в экспериментах принимали время жизни сперматозоидов после оттаивания и отмывки протектора до полной их остановки, а также % подвижных спермиев в зоне видимости микроскопа. Третьим показателем являлся процент оплодотворения икры дефростированной спермой.

Статистическую обработку результатов осуществляли с применением приемов Теории планирования экспериментов. Использован план однофакторного блочного эксперимента с дисперсионным анализом. За факторы принимали образца криопротекторов, за блоки - сперму от разных самцов. Значимость различий между факторами и блоками устанавливали с применением F-критерия Фишера.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Перед началом эксперимента было необходимо проверить ряд параметров факторов. К таковым в первую очередь относятся: возможность криоконсервации спермы осетровых рыб любого качества и установление концентраций компонентов криопротекторов.

3.1. Оценка качества нативной спермы

Русский осетр. Нативную сперму русского осетра получили от 9 самцов путем сцеживания. Результаты оценки качества представлены в табл. 1

Таблица 1.

Оценка качества нативной спермы русского осетра.

№ самца	% подвижности	Время жизни
1	100	3.47
2	100	4.30
3	100	5,30
4	100	6,53
5	100	4.40
6.	100	6.39
7	100	3.37
8	100	3.14
9	100	7.27
Уср.	100	4.9

Примечание: N = 9. М = 4.9, . m = ±0.42.

После статистической обработки вариационного ряда оказалось, что по своим показателям сперма от разных самцов русского осетра достоверно не отличается друг от друга, Ошибка измерения составила m = ±0.42, что свидетельствует о незначительном разбросе показателей. Последнее свидетельствует, что можно замораживать сперму всех самцов. В среднем количество подвижных спермиев составило 100% во всех пробах, среднее время их жизни - 4.9 минуты, что соответствует рыбоводным нормативам (3 минуты). Для глубокой заморозки отобраны пробы самцов №№ 1- 6.

Севрюга. Получена сперма от 6-ти самцов. Седьмая проба состояла из смеси спермы от разных производителей. Результаты оценки качества приведены в таблице 2.

После статистической обработки вариационных рядов оказалось, что сперма севрюги от разных самцов достоверно отличается друг от друга. Поэтому криоконсервации отобраны образца спермы от самцов №№ 1, 3, 4, 6.

Таблица 2.

Оценка качества нативной спермы севрюги.

№ самца	% подвижности.	Время жизни
1	100	13.5
2	0	0
3	100	7.55
4	80	7.03
5	0	0
6	30	5.31
7	10	2.45
Уср.	45.7	5.11

Примечание: N = 7. % подвижности: М = 45.7, m = ±2.59,

время жизни: М = 5.11, m = ±0.86.

Впоследствии была получена сперма от самцов севрюги №№ с 9 по 19. Их оценка качества представлена в таблице 3.

Таблица 3.

Оценка качества нативной спермы севрюги.

№ самца	% подвижности.	Время жизни
8	100	2.52
9	60	1.43
10	100	3.35
11	80	1.29
12	60	1.20
13-18	0	0
19	50	1.36
Уср.	64.3	1.6

Примечание: N = 7. % подвижности М = 64.3, m = ±1.9

время жизни М = 1.6, m = ±0.4.

После статистической обработки данных и их анализа установлено, что этот материал не пригоден для глубокой заморозки в жидком азоте, так как в основной массе по всем показателям данный материал не отвечает рыбоводным показателям. Если же принять во внимание ожидаемое ухудшение качества спермы по принятым показателям (% подвижных сперматозоидов и время жизни спермиев), то после температурного шока (криоконсервации) такая сперма вряд ли может демонстрировать положительные свойства при оплодотворении. Поэтому принято решение данный биологический материал исключить из эксперимента.

3.2. Подбор оптимальных концентраций составляющих протекторов

Русский осетр. В качестве основных составляющих криопротекторы веществ являлись: глицерин, ДМСО, гепарин, сахароза, яичный желток и манит. За основной показатель для оценки концентрации апробируемых веществ принимали временя жизни сперматозоидов. Результаты тестирования приведены в табл. 4.

Таблица 4.

Результаты установления концентраций.

С	Глицерин	ДМСО	Гепарин
0.1мг/0.5млі	0	0.46	2.09
0.05мл3.	2.01	0	3.10
0.025 мл3.	-	2.02	-
0.025Х 3	Смесь 2.26

Для русского осетра были отобраны ряд вариантов криопротекторов, отличающихся друг от друга составом криопротектора №№ 1. 2. 3 и 4 и режимом заморозки-разморозки. Их различия были зашифрованы под следующими обозначениями: ОТ, БОТ, АБ и АС.

Для реализации эксперимента был использован однофакторный блочный тип планирования эксперимента (Адлер, 1969), где за блоки принимали сперму от разных самцов, а за факторы - варианты криопротекторов и режимы криоконсервации. За выходные показатели выбрали как время жизни сперматозоидов, так и % живых спермиев в опыте и контроле. Результаты эксперимента приведены в таблицах 5 - 8.

Таблица 5.

Однофакторный блочный эксперимент (% живых сперимев)
Блоки
ОТ
БОТ.
А.Б.
АС
1
2
3
4
К
Tj
1
23
0
0
2
6
10
7.5
15
100
163.5
2
2
0
2
5
7.5
12.5
5
7.5
100
141.5
3
2
0
0
5
17.5
32.5
10
5
100
158
4
5
5
3
5
5
15
10
17.5
100
165.5
5
60
20
5
5
15
10
12.5
5
100
232.5
6
10
5
0
3
10
10
10
5
100
153
Ti
102
30
10
25
61
90
55
55
600
1028
Статистическая обработка результатов
Корректирующий член ТШІ/N = 1028/54 = 19570, где N= 54.
SSобщ. = ??yiІ - TЦІ/N = 69250 - 19570 = 49680.
SSфак. = ?TiІ/n - К.Ч. = 43322 - 19570 = 23742, где n = 9.
SSбл. = ?TiІ/k - К.Ч. = 9859.
Ssош. = 49680 - (23742 + 9859) = 16079
Таблица 6.
Дисперсионный анализ
Различия
Степени свободы
Сумма квадратов
Средний квадрат
Между факт.
8
23742
2967
Между бл.
5
9859
1971
Ошибка
64
16079
251
F кр. Факторы = 2967 / 7750 = 11.8.
Fкр.бл. = 1971 / 7750 = 7.8
Таблица 7.
Однофакторный блочный эксперимент (время жизни спермы)
Бло
ки
К
1
2
3
4
.ОТ
БОТ
АБ
АС
Tj
1
3.4
4.6
3.5
2.8
4.4
1
0
0
2.1
21.8
2
4.3
5.3
3.4
4.1
4.6
0.3
0
2.5
9.2
33.7
3
5.3
7.9
5.4
7.2
2.5
0.3
0
0
6.4
35
4
6.5
1.3
3.4
6.1
1.9
1.1
2.2
4.1
5.3
31.9
5
4.4
8.4
5.5
8.9
3.1
6.5
2
3.1
6.4
48.3
6
6.4
5.2
4.2
5.5
3.6
3.5
2.6
0
3.5
34.5
Ti
33
32.7
25.4
34.6
20.1
12.7
6.8
9.7
32.9
207.9
N = 54. n = 9. k = 6
Статистическая обработка результатов
К.Ч. TШІ/N = 800.4
SSобщ. = 2989.5 - 800.4 = 2189.1
SSфакт = 5630.3 : 9 - 800.4 = 625.6 - 800.4 = - 174.8
SSбл. = 1229.4 - 800.4 = 429.
SSош. = 2189.1 - (-174.8 + 429) = 1934.9
Таблица 8.
Дисперсионный анализ
Различия
Степени свободы
Сумма квадратов
Средний квадрат
Между факторами
8
174.8
21.9
Между блоками
5
429
85.8
Ошибка
64
1934.9
30.2
F кр. факторы. = 0.7; Fкр. блоки = 2.8.
Из результатов дисперсионного анализа по времени жизни спермиев после дефростации видно, что между протекторами нет значимых различий при значимости последних между блоками, т.е. все протекторы «работают» одинаково.
По полученным коэффициентам регрессии Ti по обоим видам оценки качества биологических проб были составлены ранжированные ряды (рис. 5, 6).
Рис. 5. Ранжированный ряд криопротекторов и режимов замораживания-оттаивания образцов (% живых спермиев).
Анализ ранжированных рядов свидетельствует о том, что состав криопротекторов имеет более существенное значение для сохранения жизнеспособности клеток при глубоком замораживании чем режимы заморозки-оттаивания.
Процент подвижных спермиев как показатель качества оказался менее объективным, чем время жизни клеток этого типа, так как в сравнительно короткие сроки достоверно установить величину этого показателя довольно сложно. Для получения надежных данных необходим достаточный опыт работы. Поэтому в дальнейших исследованиях принимается решение использовать его лишь как косвенные данные, пригодные для дальнейших расчетов количества дефростированной спермы при оплодотворении получаемых объемов икры.
Рис. 6. Ранжированный ряд криопротекторов и режимов замораживания-оттаивания образцов (время жизни спермиев).
Состав криопротектора № 3 по времени жизни сперматозоидов русского осетра оказался выше остальных, исследуемых в данном эксперименте.
Севрюга. В качестве контроля использовали нативную сперму (табл. 2; средне время жизни 5.11 мин., % подвижных сперимев - 45,7%). В качестве факторов использовали составы протекторов №№ 1-4. Протектор № 5 представлял собой раствор глицерина в концентрации, принятой для холоднокровных животных. Эксперимент по установлению оптимальных составов криопротекторов спланирован по типу однофакторного блочного. За факторы принимали различные составы криопротекторов, за блоки - сперму от отдельных самцов. Эксперимент реализовали в двух повторностях, что позволило существенно снизить общую ошибку. За выходные показатели взяты время жизни спермиев и процент подвижности сперматозоидов в пробе. Результаты обработаны как отдельные выборки. Последние представлены в таблицах 9 - 12.
Таблица 9.
Влияние состава криопротекторов на время жизни спермы севрюги.
Блоки
рыбы
Ф А К Т О Р Ы
Ti
1
2
3
4
5
1
0
5.30
3.29
7.17
5.37
6.24
6.26
2.18
7.50
0
43.31
2
8.25
4.20
8.50
6.14
2.27
0
7.35
4.31
2.45
0
43.47
3
4.40
3.27
5.0
3.23
7.07
7.47
3.51
4.03
0
0
37.98
4
7.24
4.01
8.40
3.24
5.50
4.03
6.55
6.16
0
0
45.13
Tj
36.67
44.97
37.95
40.35
9.95
169.9
Уср.
4.58
5.62
4.74
5.04
1.24
Статистическая обработка результатов
1. Корректирующий член (КЧ) TШІ/N = 721.7, где N = 40.
2. SSобщ. = 292.9. 3. SSфак. -= 585.2. 4. SSбл. = 1089.4, 5. SSош. = -1381.7
Таблица 10.
Дисперсионный анализ
Различия
Степени
свободы
Сумма
квадратов
Средний
квадрат
F-критерий
Между факторами
4
585.2
146.3
4.9
Междублоками
3
1089.4
363.1
12.1
ошибка
46
1381.7
30.0
Таблица 11.
Влияние состава криопротекторов на процент подвижности сперматозоидов севрюги.
Блоки
рыбы
Ф А К Т О Р Ы
Ti
1
2
3
4
5
1
0
10
5
5
15
10
10
20
5
0
80
2
10
5
10
5
120
0
15
5
10
0
70
3
5
5
5
5
10
10
5
5
0
0
50
4
10
5
5
5
15
5
10
5
0
0
60
Tj
50
45
75
75
15
260
Уср.
6.25
5.6
9.4
9.4
1.9
Статистическая обработка.
1 Корректирующий член (КЧ) = 1690, 2. SSобщ. = 925. 3. SSфак. = 1510, 4. SSбл. = 2660, 5. SSош. = 3245.
Из результатов дисперсионного анализа видно, что между факторами и между блоками в обоих случаях существуют статистически значимые различия. Последнее означает, что сперма от отдельных самцов севрюги существенно отличается друг от друга. Так сперма самцов 1 и 2 являются наилучшими по времени жизни (коэффициенты регрессии 80 и 70 соответст-венно). Худшей оказалась сперма самца № 3 (коэфф. регр. 50). Между криопротекторами различия статистически значимы (Fкр. = 4.9 и 5.4, Fтабл. = 2.26). Исходя из этого возможно построить ранжированные ряды «работы» криопротекторов, где «качество» их действия по обоим показате-лям располагали в порядке убывания Уср. (табл. 9 и 11). Ранжированные ряды представлены на рис. 7 и 8.
Таблица 12.
Дисперсионный анализ.
Различия
Степени свободы
Сумма квадратов
Средний квадрат
F-критерий
Между факторами
4
1510
377.5
5.4
Между
Блоками
3
2660
886.7
12.6
ошибка
46
3245
70.5
Рис. 7. Ранжированный ряд действия криопротекторов на
время жизни сперматозоидов севрюги.
Рис. 8. Ранжированный ряд действия криопротекторов на
процент подвижных сперматозоидов севрюги.
Из рис. 8 видно, что процент подвижности дефростированной спермы существенно уступает нативной. Вместе с тем, данный показатель, как и в эксперименте с русском осетром является субъективной оценкой, так как в поле зрения микроскопа попадает в этом состоянии далеко не все подвижные спермии. В то же время было установлено, что при замораживании и дефростации у некоторых спермиев обламываются хвосты, однако сама клетка остается целой и способной к оплодотворению. Если в естественных условиях данная аномалия играет отрицательную роль при оплодотворении, то при искусственном перемешивании дефростированной спермы с икрой в ограниченном пространстве (таз) этот показатель не может играть определяяющей роли при оценки качества спермы.
Таким образом единственной экспресс оценкой размороженной спермы может служить время жизни спермиев после оттаивания. Последнее также является критерием при отборе проб в производство. Из рис. 7 видно, что использование криопротектора № 2 увеличивает время жизни спермиев по сравнению с контролем. Последнее, по-видимому, обусловлено тем, что при двойном термическом ударе (заморозка-оттаивание) наиболее слабые спермии погибают и остаются более сильные клетки, способные к оплодотворению. Составы криопротекторов №№ 4, 3 и 1 оказались хуже контроля, следовательно их использование для рыбоводного процесса с севрюгой целесообразно исключить, а глицерин (крипротектор № 5) вообще не пригоден для использования при криоконсервации спермы осетровых рыб.
Различия в составах криопротекторов для русского осетра и севрюги свидетельствует об видовой специфичности спермы данных видов рыб. Исходя из этого является необходимым для каждого вида осетровых рыб подбирать определенные составы криопротекторов, где основными компонентами остаются базовый раствор, сахароза, яичный желток, манит и ДМСО. Гепарин рекомендуется использовать при дефростации замороженных образцов с целью предотвращения слипания клеток.
Заключение

На основании проведенных экспериментов возможно сделать следующие выводы:
1. Самцы русского осетра и севрюги по качеству половых продуктов достоверно различаются друг от друга. Поэтому при криоконсервации необходимо отбирать сперму только высокого качества, отвечающую стандартным рыбоводным показателям.
2. Из двух показателей качества спермы на промежуточных этапах криоконсервации наиболее адекватным является время жизни спермиев (до остановки последнего сперматозоида в поле видимости микроскопка). Процент подвижных спермиев может служить лишь косвенной оценкой так как здесь присутствует фактор субъективности исследователя. Слишком высока ошибка за счет исследователя.
3. Основными компонентами криопротекторов для осетровых рыб являются: ДМСО и манит. Базовый раствор необходим для поддержания РН среды при введении разных составляющих. Сахарозы и яичный желток необходимы как энергетический запас для клеток после двойного термического шока (заморозка - разморозка).
4. Рецептуры разный криопротекторов отличаются соотношением основных компонентов.
5. Составы криопротекторов для русского осетра и севрюги оказались разными. Это свидетельствует о том, что последние являются видоспецифичными для спермы разных видов осетровых рыб. Исходя из этого, при криоконсервации спермы новых видов осетровых необходимо подбирать новый состав криопротектора.
Список использованной литературы
1. Абдуллаев М.А., Бакаев С.Б., Пославский А.Н. Экологические проблемы охраны живой природы. //М., 1990, т 1, с.75.
2. Андреев А.А., Петропавлов Н.Н. Генетические криобанки в проблеме сохранения биоразнообразия. //В. сб научных трудов «Консервация генетических ресурсов» Пущино. 1994, -С 35-81с.
3. Ананьев В.И., Гахова Э.Н., Катосонов В.Я., Ротт Н.Н., Цветкова Л.И. Концепция сохранения и устойчивого использования биоразнобразия с применением методов криоконсервации геномов гидробионтов. // М, 1997, с 1-36.
4. Ананьев В.И. Новые технологии криоконсервации биологических объектов для управления биоразнообразием в аквакультуре и природных популяциях. //Рыбное хоз-во. Сер. Аквакультура: Информационный пакет. ВНИЭРХ, 1997, вып. 1, с. 36-47.
5. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. //М. «Наука» 1989, -125 с.
6. Баранникова И.А., Никоноров С., Белоусов Л.Н. Проблема сохранения осетровых России современный период. /Международная конферен-ция «Осетровые рубеже 21 века». Астрахань. 11 -15 сент. 2000, Тезисы докладов. //Астрахань. 2000. - С. 7-8.
7. Белоус А.М., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Замораживание и криопротекция. //М. «Высшая школа» 1987, 80с.
8. Брегман Ю.Э., Найденко Т.Х. Криоконсервация геномов гидробионтов. //Бюлл. Дальневосточного отдел. РАН. 1992, № 1-2. -С76-78.
9. Будыко М.И. Глобальная экология. // М., «Мысль» 1977, 126 с.
10. Букварева Е. Н. Сохранение генофонда животного мира и проблема минимальной численности популяции. //Консервация генетических ресурсов. Пущино, ОНТИ ПИЦ РАН. 1985г, 27с.
11. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Экспериментальные и теоретические предпосылки получения живых животных из клеток, несущих генетическую информацию. В серии: Консервация генетических ресурсов. //Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН. 1980, 71с.
12. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Консервация генетических ресурсов. Информационный материал. //Пущино, 1981, - 24с.
13. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н Проблема сохранения генофонда. /М. «Знание». 1985, -С 1-59.
14. Вепринцев Б.Н,. Ротт Н.Н. Стратегия сохранения животного и растительного мира Земли. Консервация генетических ресурсов. //Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН. 1991г. -с 5-35.
15. Вуд М., Уиттингхем Д., Ролл. Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши. Биология развития млекопитающих. Методы. М., Мир. 323-356с. 1990г.
16. Гахова Э.Н. Митохондрии спермиев лягушки при замораживании. /В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1994, т. 6, -С 47 - 55.
17. Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Лучко Н.А. Некоторые аспекты криоконсервации эмбрионов и спермы. // Проблемы криобиологии, № 2. 29-36с. 1994г.
18. Дьяконов Л.П. Основные достижения и перспективы развития клеточной биотехнологии. //Труды ВИЭВ. т.71. 1998.
19. Карамарова Л.И., Гахова Э.Н., Карнаухов В.Н. Гипометаболические факторы зимоспящих как возможные регуляторы резистентности клеток к низким температурам. / В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1994, т. 6, -С 47- 55.
20. Карнаухов А.В. О роли биоразнообразия в сохранении климата Земли. // В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1981, -С 34-54.
21. Карнаухов В.Н., Карнаухов А.В. Возможность экологической катиастрофы и снижения биоразнообразия в пресных водах Северной Америки. /В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1994, т. 6, -С 17 - 20.
22. Карнаухов В.Н. Спектральный анализ в клеточном мониторинге состояния окружающей среды. //М «Наука» 2001, -186 с.
23. Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Наук В.А. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. //Л.: Агропром-издат. Ленинградское отделение. 1998, 186 с.
24. Лозино-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. Адаптации и устойчивость организмов и клеток к низким и сверхнизким температурам. //Л: Наука. 1972, 288с.
25. Малютин B.C. Проект федеральной программы по сохранению и устойчивому использованию осетровых рыб, включая комплекс мер по развитию искусственного воспроизводства и товарного осетроводства. Международная конференция "Осетровые на рубеже 21 века", Астрахань, 11--15 сент., 2000: Тезисы докладов. //Астрахань, 2000. -- С. 12--14.
26. Межевикина Л.М., Каранова М.В. Использование антифризных гликопротеинов при замораживании в жидком азоте ранних зародышей мыши. //Известия. Акад. наук. Сер. биол. 1995. -С 113 - 145.
27. Мельников В.Н., Прямухина Н.В. О мерах по сохранению и восстановлению запасов осетровых в Каспийском бассейне. Международная конференция "Осетровые на рубеже 21 века", Астрахань, 11--15 сент., 2000. Тезисы докладов. //Астрахань. 2000. -- С. 77--78.
28. Наук В.А., Борончук Г.В., Ротт Н.Н. Длительное сохранение спермы сельскохозяйственных и диких животных. //В. сб научных трудов «Консервация генетических ресурсов» Пущино. 1991, -С35-81.
29. Никитин В.А. Технология генетически идентичных близнецов. Возможности и перспективы. /В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1994, т. 6, -С 56 - 61.
30. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей.//Киев: Урожай.. 1978, 255с.
31. Павлов Д.С. Подходы к охране редких и исчезающих рыб. Информационный материал. //Научный центр РАН, Пущино, 1993, 126 с.
32. Розанов Р.М., Каримов Б.К. Экологические проблемы охраны живой природы, //М. «Высшая школа», 1990, т.1, с. 70.
33. Розанов С.И. Место генетических криобанков в решении проблемы сохранения биоразнообразия. /В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1994,т.6, -С 8-13.
34. Ротт Н.Н. Создание генетических криобанков и использование методов биологии развития как способ сохранения редких видов. //М, Журнал ВНД, 1996, Т. 27. № 4, -С 45-48.
35. Ротт Н.Н. Создание генетических криобанков и использование методов биологии развития как способ сохранения редких видов животных. Криоконсервация спермы диких млекопитающих. // Онтогенез. 1995 т 26. №4. 270-281с.
36. Савушкина С.И. Влияние криоконсервации на подвижность сперматозоидов русского осетра (Acipensеr gueldenstadti br.) //2-й Междуна-родный симпозиум "Ресурсосберегательные технологии в аквакультуре", Адлер, 4--7 окт., 1999. //Матер. докладов. Краснодар, 1999. - С. 90.
37. Сулей М., Уилкокс Б. Биология охраны природы. //М., Мир, 1983, 430с.
38. Сулей М. Жизнеспособность популяций. //М., Мир 1989, 224 с.
39. Тихомиров А. М. Витвицкая Л. В. Курс лекций по дисциплине «осетроводство» часть 3. //Астрахань, АГТУ, 2001, 125 с.
40. Шпаро М.И. Криопротекторы. Криоконсервация клеточных суспензий. //Киев, «Наукова Думка, 1983. 289 с.
41. Яблоков А.В., Остроумов С.А. Охрана живой природы: проблемы и перспективы. //М., Лесн. пром., 1983г. 269с.
42. Fahy G.M. The relevance of cryopotectant “toxicity” to cryobiology. //”Cryobiology”, 1986, 23. -p. 1-13.
43. Grunina F.S., Neifakh F.F. Induced diploid androgenesis. //Phisiol/ end Gen. Biologi rev., 1997 v/ 13, part 1, -p. 73-103.
44. Somme L. Supercooling and winter survival in terresthal arthopods. //Comp. Biochem. Phisiol. 1982, 73A, -р. 519 - 543.

Страницы: 1, 2